質粒提取步驟

一、實驗原理:
        堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA 與線性染色體DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ~12.5 這個狹窄的范圍內,線性的DNA 雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA 的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時,共價閉合環狀的質粒DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,而線性的染色體DNA 的兩條互補鏈彼此已完全分開,復性就不會那么迅速而準確,它們纏繞形成網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA ,蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。
 
二、操作步驟:
        1. 準備20ml滅菌過的培養管,編號,分別加入8ml LB培養基,再加入8µl 相應抗生素,可適量多加;

        2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個菌落至培養管中,37℃震蕩過夜(274rpm);
        3. 取2ml過夜培養的菌液加入離心管中,室溫10000rpm離心2min,去上清;(可重復步驟2,直至菌液離心完)(去上清時用紙吸一下)
        4. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl Buffer P1(含RNase A),使用移液槍充分混勻,懸浮菌體菌體;
        5. 向離心管中加入250µl Buffer P2,溫和地上下顛倒混勻4~6次,獲得澄清的裂解液;(劇烈混合會使剪切染色體DNA,降低質粒純度)
        6. 向離心管中加入350µl Buffer N3, 立即溫和地上下顛倒混勻4~6次,此時出現白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心15min;
        7. 小心將步驟6中所得的上清液轉移至潔凈的吸收柱中。要保證沒有吸入沉淀和細胞碎片。室溫10000rpm離心1min,至裂解物完全通過吸收柱,倒掉收集管中的廢液;
        8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB,10000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液;
        9. 向吸附柱中加400µl  Buffer PW(檢查是否加入無水乙醇),10000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液。再空離一次,2min(此時可以加熱 Buffer EB,65~70℃);
        10. 將吸附柱置于一個新的離心管中,打開蓋子,吹風4min左右(確保乙醇被去除,乙醇會影響下面的步驟);
        11. 向吸附柱的吸附膜中間部位加90µl Buffer EB(pET系列拷貝數低,加EB 70μl即可),室溫靜置2min。10000rpm離心1min;
        12. 把液體倒回吸附柱,在10000rpm離心1min;
        13. 混合質粒至一個離心管中,做好標記,開蓋室溫放置兩小時左右。-40℃保存質粒。
 
三、注意事項:

        1.使用之前,把試劑盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1, 4℃保存。
        2.Buffer EB在65~70℃水浴預熱,可以增加提取效率。
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